米乐的网址:DageMTI IR-2000摄像机一种用于探测肾上腺素能神经回路的光激活去甲肾上腺素

　　神经调质去甲肾上腺素（NE）在神经系统中发挥着基础性作用，它通过介导注意力、可塑性以及记忆巩固等过程来实现这些功能。此外，去甲肾上腺素水平的失衡与注意力缺陷多动障碍以及抑郁症都有关系。去甲肾上腺素通过作用于中枢神经系统中多种不同细胞类型（包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞）上的多种受体，来执行其广泛的神经调节功能。鉴于去甲肾上腺素在中枢神经系统（CNS）中的基础性作用以及其细胞靶点的多样性，剖析这个复杂的神经调节系统的工具对于理解其众多功能至关重要。

　　东莞富临医疗科技有限公司是Dage-MTI在亚洲的代理商，富临医疗为亚洲客户提供“红外摄像机”与“光电生理产品”

　　最近，人们努力剖析去甲肾上腺素能神经回路的逻辑，这促使了基于去甲肾上腺素的工具的开发，这些工具既可以检测内源性去甲肾上腺素的活性，又可以在实验中刺激或抑制去甲肾上腺素的释放。去甲肾上腺素荧光传感器的开发，如 GRABNE 以及基于碳纳米管的去甲肾上腺素纳米传感器，使得在体内检测内源性去甲肾上腺素的释放成为可能。为了操控去甲肾上腺素能神经回路，许多研究小组通过光遗传学方法激活或抑制蓝斑核（LC），从而在整个中枢神经系统中刺激或抑制去甲肾上腺素的释放。虽然对蓝斑核的光遗传学激活提供了一种与生理相关的释放空间模式，但这种空间模式本质上是广泛分布的，其靶点涵盖中枢神经系统的许多区域。由于它们具有高度的侧支化特性，即使是对单个轴突或神经元的靶向刺激，也可能会引起去甲肾上腺素在相对广泛的区域内释放。此外，研究表明蓝斑核神经元有能力同时释放多巴胺和去甲肾上腺素。

　　因此，为了提供一种能够以更高的空间精度探测去甲肾上腺素能神经回路，并分离出去甲肾上腺素对细胞和神经回路的特定作用的工具，我们开发了一种光激活的去甲肾上腺素。

　　光激活化合物已被证明是用于绘制 γ- 氨基丁酸能（GABAergic）和谷氨酸能回路功能连接图、确定受体定位以及神经元亚细胞结构上突触输入位置的有力工具。光激活化合物是一种被 “笼” 在保护基团内的分子，在吸收光后会释放开来。这种反应发生迅速，并能通过改变光强度和光束大小来调节释放的分子数量。因此，光激活化合物能够以时间和空间上精确的方式释放分子，而不会对样本造成机械干扰。此前已经开发出了一种光激活去甲肾上腺素（NE）。然而，它是由紫外线光谱的光激活的，紫外线会对生物组织造成损伤，并且难以穿透生物组织。因此，一种由可见光激活的新型光激活去甲肾上腺素，将极大地提高我们探测去甲肾上腺素能回路的能力，就如同光激活谷氨酸和 γ- 氨基丁酸（GABA）使得对它们各自的回路和受体进行详细绘制成为可能一样。

　　二十年前首次出现了钌联吡啶笼状化合物，它是一种将激活光谱扩展到更长波长的新方法。这些笼状结构由一个钌核心组成，该核心与一个或两个联吡啶或类似分子以及一个或两个单齿配体相配位。这些配合物在可见光区域（通常是蓝绿色光）有很强的吸收性，对应于一个金属到配体的电荷转移（1 MLCT）带。当这种能带受到照射时，会在几十纳秒内快速发生一系列反应，形成一个解离的 d-d 态，这会导致其中一个单齿配体（通常是目标分子）释放开来。剩余的单齿配体可用于调节配合物的化学和光化学性质。

　　在这里，我们描述了钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）的合成过程及其化学性质，它在吸收可见光后会释放出去甲肾上腺素（NE）。此外，我们通过调节蓝斑核（LC）神经元的放电速率，展示了它在生物系统中的应用，而蓝斑核神经元已知是由去甲肾上腺素进行自我调节的。

　　未来，钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）能够以时间和空间上精确的方式，用去甲肾上腺素刺激细胞和神经回路。有明确的目的性地释放去甲肾上腺素，将能够对去甲肾上腺素能神经回路的功能连接进行精细的绘制，同时也能够探究去甲肾上腺素是如何作用于中枢神经系统（CNS）中的非神经元细胞的。以这种精确程度剖析去甲肾上腺素能神经回路的能力，将有利于该领域更深入地理解去甲肾上腺素是如何执行其广泛的神经调节功能的。

　　尽管钌联吡啶（RuBi）笼状化合物的合成过程相对直接明了，但要得到钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE），必须格外小心，因为游离的去甲肾上腺素（NE）酚基在配位所需的碱性介质中易发生氧化反应。因此，合成过程必须在深度厌氧条件下，使用施伦克（Schlenk）操作法进行（详见方法部分）。一旦制备完成，钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）是一种稳定的固体，可以在室温下储存，不过若要长期保存，最好放置在零下 15 摄氏度的冰箱中。在低 pH 值条件下，钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）是带 + 2 电荷的阳离子，不过在生理条件下，其酚基可能会部分去质子化。

　　为了确认钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）配合物的生物相容性，并评估其作为去甲肾上腺素光触发器的性能，我们在含有蓝斑核（LC）的急性脑切片上进行了一系列电生理实验。

　　首先，我们通过将在蓝斑核（LC）神经元中表达 Cre 重组酶的小鼠品系（TH-Cre）与 Cre 诱导型荧光报告基因品系（Ai14）杂交，使红移荧光分子 TdTomato 在蓝斑核（LC）神经元中特异性表达，从而确定了用于记录的蓝斑核（LC）神经元（图 1a）。这些经过荧光标记的神经元呈现出蓝斑核（LC）神经元胞体典型的较大形态。接下来，我们将这些细胞作为全细胞膜片钳记录的目标细胞，在移液管溶液中加入 Alexa 荧光染料，以确认被钳制的是正确的细胞（图 1a）。被钳制的细胞保持在电流钳模式下，我们观察到这些神经元会自发地产生动作电位（APs），这与之前的描述一致。我们利用了蓝斑核（LC）神经元自身表达 α2 肾上腺素能受体（ARs）这一事实，而去甲肾上腺素激活这些受体的作用是抑制这些细胞的动作电位发放。我们通过用 30 微摩尔的去甲肾上腺素浸泡脑切片来证实这种细胞行为，并且正如预期的那样，观察到动作电位发放明显减少（图 1b）。因此，我们推断，在被钳制的细胞处，去甲肾上腺素的任何增加都会导致动作电位发放减少。

　　为了测试钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）的光激活是否会导致局部去甲肾上腺素（NE）增加，我们将钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）添加到含有标准人工脑脊液（ACSF）的浸泡液中，且不添加任何额外的去甲肾上腺素。我们第一步证实，浸泡液中的钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）不会改变被钳制神经元的细胞活性，两种条件下（人工脑脊液组：1.94 ± 0.31 次脉冲 / 秒；钌联吡啶 - 去甲肾上腺素组：2.09 ± 0.10 次脉冲 / 秒，p = 0.60，非配对 t 检验）的动作电位发放速率没有变化。然而，当使用 446–486 纳米的蓝光进行单光子（1P）激活（10 毫秒）时，我们观察到动作电位发放速率持续下降（图 1c、d [上]、e [中]），这表明去甲肾上腺素确实被光释放开来了。蓝光本身对动作电位发放没有一点影响，因为当浸泡液中不添加钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）时，没有观察到同样的效果（图 1e，左）。接下来，为了确认动作电位发放的变化是由于去甲肾上腺素的释放和肾上腺素能受体（ARs）的激活所导致的，咱们进行了相同的单光子光激活实验，但在浸泡液中除了钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）之外，还添加了 α2 肾上腺素能受体拮抗剂（伊达唑安，2 微摩尔）。在这些实验中，当用蓝光激活时，我们不再观察到动作电位发放的变化（图 1d [下]、e [右]），尽管伊达唑安本身会像之前的研究那样增加发放速率 。这一些数据表明，钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）的光激活会特异性地增加局部去甲肾上腺素的浓度。

　　为了展示去甲肾上腺素（NE）光激活对蓝斑核（LC）神经元的时间动力学影响，我们还计算了 10 毫秒蓝光脉冲前后动作电位（APs）之间的峰间间隔（ISI）。在对峰间间隔进行量化时，我们得知在蓝光光激活之前，不同条件下（钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）组：分别为 0.5151 ± 0.0082 秒、0.4984 ± 0.007 秒；人工脑脊液（ACSF）组：0.5992 ± 0.0578 秒、0.6453 ± 0.0545 秒；钌联吡啶 - 去甲肾上腺素 + 伊达唑安（RuBi-NE + idazoxan）组：0.3794 ± 0.1227 秒、0.3071 ± 0.0473 秒，分别对应光脉冲前的两个峰间间隔）没有显著差异，但与人工脑脊液条件相比，当浸泡液中有钌联吡啶 - 去甲肾上腺素时，光脉冲后的峰间间隔出现了显著延迟（钌联吡啶 - 去甲肾上腺素组：5.1641 ± 0.7551 秒、9.2122 ± 0.8788 秒、2.45165 ± 0.1469 秒；人工脑脊液组：0.6735 ± 0.0454 秒、0.6549 ± 0.0424 秒、0.6708 ± 0.0516 秒；钌联吡啶 - 去甲肾上腺素 + 伊达唑安组：0.2201 ± 0.0109 秒、0.1901 ± 0.051 秒、0.2252 ± 0.0226 秒，分别对应包括光脉冲及紧随其后的三个峰间间隔。采用双向方差分析（Two-way ANOVA），随后进行邦费罗尼（Bonferroni）检验来确定不同条件和峰间间隔之间的显著成对比较；光脉冲后第一个和第二个峰间间隔之间，钌联吡啶 - 去甲肾上腺素组和人工脑脊液组相比，p = 0.0492）（图 1f，绿色）。当仅在人工脑脊液中进行实验时（图 1f，黑色），或者当在浸泡液中同时使用钌联吡啶 - 去甲肾上腺素和伊达唑安时（图 1f，粉色），没有观察到这些峰间间隔延迟的情况。

　　同样地，当我们量化每个动作电位相对于光脉冲的绝对时间时，我们得知钌联吡啶 - 去甲肾上腺素 10 毫秒的光释放显著延迟了后续动作电位的发放，使得光脉冲后的第二个和第三个动作电位分别在光刺激后 14.0546 ± 0.9813 秒和 16.47 ± 1.0317 秒出现（图 1g，绿色），而对照组光脉冲后的动作电位分别在 1.05 ± 0.0603 秒和 1.73 ± 0.1042 秒，以及 0.3068 ± 0.1407 秒和 0.53 ± 0.1633 秒出现（图 1g，分别为黑色和粉色，采用双向方差分析，随后进行邦费罗尼检验来确定不同条件和动作电位之间的显著成对比较；在第二个和第三个峰处，钌联吡啶 - 去甲肾上腺素组和人工脑脊液组相比，p 分别为 0.0044 和 0.00040）。

　　总之，这一些数据表明，钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）是一种可靠且特异性的去甲肾上腺素光触发器。

　　在这里，我们介绍了 [Ru (bpy)₂(PMe₃(Norepinephrine)]ⁿ⁺（钌联吡啶 - 去甲肾上腺素，RuBi-NE）的研发情况，这是一种可被可见光激活并释放去甲肾上腺素（NE）的物质。我们在含有蓝斑核（LC）的急性小鼠脑切片中，通过单光子解笼实验验证了去甲肾上腺素的释放。我们得知，用短暂的蓝光脉冲对钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）进行解笼操作，会通过 α₂肾上腺素能受体暂时降低蓝斑核（LC）动作电位的发放速率。这种新工具能够在不对组织造成机械干扰的情况下，实现去甲肾上腺素在时间和空间上的精确释放，而机械干扰本身也有一定可能会调节细胞活性。

　　我们对单光子去甲肾上腺素解笼的验证表明，去甲肾上腺素会在较大的视野范围内（即解笼光束的大小范围内）释放。考虑到蓝斑核（LC）神经元在整个大脑中广泛的投射，并且它们通过容积传递的方式释放去甲肾上腺素，这种去甲肾上腺素的广泛释放与生理情况是相关的。虽然这种在空间上扩散的解笼方式能用来研究去甲肾上腺素的特定作用，将其与突触末端可能的共释放作用隔离开来，但为了可以以亚细胞空间精度绘制去甲肾上腺素能神经回路图，还需要像对其他钌联吡啶（RuBi）亚型所做的验证那样，对钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）的双光子兼容性进行验证。

　　这种光激活化合物的合成和验证，使得去甲肾上腺素加入到了一系列可被 “笼” 在钌联吡啶主链中的神经递质和神经调质的行列，从而扩展了可用于绘制中枢神经系统中神经元和非神经元细胞的功能回路图以及确定受体定位的工具集。

　　图 1. 钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）的光释放特异性地增加了局部去甲肾上腺素（NE）的浓度。(a) 用于记录的蓝斑核（LC）神经元的代表性图像。左侧：记录前蓝斑核（LC）神经元的微分干涉相差显微镜（DODT）对比度图像；虚线标记了胞体。中间：全细胞膜片钳配置前，tdTomato 阳性的蓝斑核（LC）神经元的单光子（1P）图像。右侧：处于全细胞膜片钳配置下的同一蓝斑核（LC）神经元的双光子（2P）图像，用 Alexa 594 进行透析。细胞左上角边界处显示了膜片钳电极。(b) 电流钳配置下蓝斑核（LC）神经元自发动作电位（AP）发放模式的代表性记录曲线 秒时，向浸泡液中施加去甲肾上腺素（30 微摩尔）（黑色条）。(c) 钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）解笼前后蓝斑核（LC）神经元的代表性活动情况。蓝色线 毫秒的蓝光解笼脉冲。(d) 在使用伊达唑安（2 微摩尔）阻断 α2 肾上腺素能受体（ARs）之前（上）和期间（下），钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）解笼前后的代表性活动情况（放大显示）。蓝色矩形标记了 10 毫秒的蓝光脉冲。(e) 人工脑脊液（ACSF）中蓝斑核（LC）神经元的平均动作电位发放次数 / 秒（2 个细胞中的 8 次脉冲，左侧）、300 微摩尔钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）中（4 个细胞中的 14 次脉冲，中间）以及 300 微摩尔钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）+ 2 微摩尔伊达唑安中（1 个细胞中的 2 次脉冲，右侧）。时间 0 表示光脉冲发生的时刻。(f) 左侧：显示相对于光脉冲的动作电位编号的示例记录曲线。右侧：人工脑脊液（ACSF）中蓝斑核（LC）神经元的平均峰间间隔（ISI）（2 个细胞中的 8 次脉冲）、钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）中（4 个细胞中的 14 次脉冲）以及钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）+ 伊达唑安中（1 个细胞中的 2 次脉冲）。-1:+1 是解笼发生期间的峰间间隔。采用按条件和峰间间隔编号分组的双向方差分析（Two-way ANOVA），随后进行邦费罗尼（Bonferroni）检验来确定显著的成对比较，* 表示 p 0.05。(g) 人工脑脊液（ACSF）、钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）以及钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）+ 伊达唑安中，蓝光脉冲后前三个动作电位的平均绝对时间。采用按条件和动作电位编号分组的双向方差分析（Two-way ANOVA），随后进行邦费罗尼（Bonferroni）检验来确定显著的成对比较，** 表示 p 0.01，*** 表示 p 0.001。

　　所有化学试剂均购得且未经进一步纯化直接用。二氯・二（2,2- 联吡啶）钌（Ru (bpy)₂Cl₂）是根据文献方法合成的。由此，按照先前描述的方法得到了六氟磷酸 [Ru (bpy)₂(PMe₃)(Cl)]（[Ru (bpy)₂(PMe₃)(Cl)] PF₆）。为了合成 [Ru (bpy)₂(PMe₃)(去甲肾上腺素)]²⁺（[Ru (bpy)₂(PMe₃)(Norepinephrine)]²⁺），将 300 毫克的 [Ru (bpy)₂(PMe₃)(Cl)] PF₆溶解在 3 毫升丙酮中，然后加入 15 毫升水。将该混合物与负载甲磺酸根的离子交换树脂一起搅拌过夜。蒸发掉丙酮后，将生成的 [Ru (bpy)₂(PMe₃)(H₂O)] Mes₂溶液与树脂分离。从这一步开始，所有操作均在氮气环境下进行，且溶液事先用氩气或氮气除气。将 450 毫克盐酸去甲肾上腺素加入到一个施伦克（Schlenk）烧瓶中，通过加入 2 毫升 1 摩尔每升的氢氧化钠将 pH 值调节至 9 到 10。当通过紫外 - 可见光谱法确认去甲肾上腺素配合物已形成后，将混合物在冰浴中冷却，并加入 1 摩尔每升的乙酸以降低 pH 值，并防止在后续操作中去甲肾上腺素被空气中的氧气氧化。将溶液过滤，加入 2 毫升 0.5 摩尔每升的六氟磷酸钾（KPF₆）后，Ru (bpy)₂(PMe₃)(去甲肾上腺素)₂（Ru(bpy)₂(PMe₃)(NE)₂）配合物以橙色粉末的形式沉淀出来。为了制备更易溶解的产物，能更加进一步用负载甲磺酸根的离子交换树脂进行离子交换。

　　使用振动切片机，从出生后第 28 至 34 天（P28–P34）的 TH-Cre⁺;Ai14⁺和 TH-Cre⁺; Ai9⁺/- 雌性小鼠的脑干中，在脑桥水平制备包含蓝斑核（LC）的水平脑切片（350 微米）。切片溶液冷却至零下 20 摄氏度，其成分（以毫摩尔每升计）为：222 蔗糖、27 碳酸氢钠（NaHCO₃）、2.6 氯化钾（KCl）、2 硫酸镁（MgSO₄）、2 氯化钙（CaCl₂）、1.5 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄），并通入 95% 的氧气和 5% 的二氧化碳进行鼓泡。将切片在 35 摄氏度的人工脑脊液（ACSF）中孵育 30 分钟，然后保持在室温下，直至记录开始。记录用的人工脑脊液成分（以毫摩尔每升计）为：123 氯化钠（NaCl）、26 碳酸氢钠（NaHCO₃）、10 葡萄糖（dextrose）、3 氯化钾（KCl）、2 硫酸镁（MgSO₄）、2 氯化钙（CaCl₂）、1 磷酸二氢钠（NaH₂PO₄），同样通入 95% 的氧气和 5% 的二氧化碳进行鼓泡。

　　使用正置显微镜上的微分干涉相差显微镜（DODT）观察神经元，通过连接有红色滤光片组（TRITC-B-000）的落射荧光灯来识别经荧光标记的 tdTomato 阳性的蓝斑核（LC）神经元。使用 40 倍的近红外复消色差（NIR Apo）/0.80W 物镜和红外电荷耦合器件（CCD）实时相机（IR2000，DAGE-MTI）对神经元进行观察。使用放大器进行记录，并通过 Prairie View 5.4 软件以 10 千赫兹的速率采集数据。膜片钳电极（尖端电阻为 6-7 兆欧，硼硅酸盐玻璃材质，外径 1.5 毫米，内径 0.86 毫米）中填充有以下内部溶液（以毫摩尔每升计）：135 甲基硫酸钾、10 氯化钾（KCl）、10 羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、5 氯化钠（NaCl）、0.025 Alexa 594，pH 值为 7.3（用氢氧化钾（KOH）调节）。串联电阻在 15-30 兆欧之间，并对电极电容进行了补偿。以电流钳模式记录神经元数据。在不注入电流的情况下，神经元的静息膜电位（Vm）约为 - 50 毫伏。

　　一旦神经元处于全细胞膜片钳配置状态，闭所有灯光，并将浓度为 10 毫克 / 毫升的钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）在人工脑脊液（ACSF）中的储备液添加到浸泡液中，使最终钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）的浓度达到 300 微摩尔。在记录过程中，通过单光子（1P）激发，用单个 10 毫秒的蓝光脉冲（446-486 纳米）对钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）进行光解。将盐酸伊达唑安（2 微摩尔）添加到人工脑脊液浸泡液中，以确认钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）是通过 α2 肾上腺素能受体作用于神经元的。

　　数据以平均值 ± 标准误（SEM）的形式报告。光脉冲前的平均发放速率通过计算各脉冲的平均发放速率得出。使用非配对 t 检验计算 p 值，以比较人工脑脊液（ACSF）和钌联吡啶 - 去甲肾上腺素（RuBi-NE）两种条件下光脉冲前的平均发放速率。其余的 p 值通过双向方差分析（ANOVA）计算，随后进行邦费罗尼检验，以确定不同条件和时间点之间的显著成对比较。